血小板在维持正常止血中起着关键作用，同时也被认为是动脉血栓形成的重要因素。自光透射聚集测定法问世以来，世界各地的实验室一直致力于血小板功能检测。本文除介绍血小板功能检测的临床应用外，还根据检测目的不同，对不同方法的检测原理及优缺点进行论述。
01初期止血
血管病变引起的血管收缩主要由受损内皮合成的内皮素-1介导。同时，内皮下胶原暴露，内皮细胞释放血管性血友病因子( von Willebrand factor，VWF )和三磷酸腺苷( adenosine triphosphate，ATP ) 。随后，血小板通过与VWF和内皮下胶原的剪切作用粘附在内皮上，导致血小板活化。其次，血小板分泌细胞质颗粒。
血小板胞浆颗粒包括5 -羟色胺( serotonin )、血小板活化因子和二磷酸腺苷( adenosine diphosphate，ADP )等，其中ADP是一种重要的生理激动剂。ADP与血小板膜受体P2Y1和P2Y12结合，辅助血小板聚集。此外，活化的血小板会从花生四烯酸合成血栓素。
A2，这是由环氧化酶1催化的反应。血栓素A2从血小板磷脂膜上释放，进一步刺激新的血小板活化并促进血小板聚集。在糖蛋白( GP )Ⅱb /Ⅲa受体的连接下，血小板与纤维蛋白原一起形成初级血小板血栓。最后，当纤维蛋白原通过以凝血酶为主要参与者的继发性止血作用转化为纤维蛋白时，脆弱的初级血小板栓子就稳定下来了。
02血小板功能检测的临床应用
血小板功能检测可用于不同的临床情况：急性出血患者、遗传性血小板功能障碍性疾病的诊断以及抗血小板治疗的疗效检测。一些血小板功能试验可用于研究血小板疾病，而另一些具有较低的敏感性，仅适用于血小板功能筛查或抗血小板治疗的疗效评估。
1.血小板功能检测：通过一个或多个途径激活静息的血小板可导致多个过程，包括与内皮细胞的粘附、与其他血小板的聚集和脱颗粒，这些过程由表面受体和下游信号介导。目前使用的实验室检查能反映血小板功能的不同方面；但没有一种检测可以反应整个过程的所有部分。特别是，目前的方法无法评估血管对血小板活化和聚集的作用。
表1 目前应用最广泛的血小板功能测定试验，原理、临床应用、优缺点
在患者样本中加入激动剂可启动体外血小板活化。加入激动剂后，与血小板相关受体结合从而激活血小板。不同激动剂诱导的聚集程度可用于区分血小板疾病或量化其严重程度。最常用的聚集激动剂见表2。在研究抗血小板药物的效果时，会使用针对受阻受体的激动剂。而ADP被用于ADP受体抑制剂的疗效测试。
表2 血小板功能检测最常用的激动剂
血小板功能可以在全血或富血小板血浆( platelet-rich plasma，PRP )中进行评估。分析抗凝全血中的血小板聚集，由于减少了样本处理，节省了时间。全血可以被视为更符合生理环境，可以更真实地反应血小板聚集的潜力；然而，血小板与血管壁的相互作用在这两种方法中均未被评估。相反，分析PRP中的血小板功能也可能存在处理过程中因离心而带来的血小板活化或血小板亚群丢失的风险。
2.光学法血小板聚集率检测：使用LTA，通过测量加入血小板激动剂后PRP透光度的变化来评估血小板聚集。由于LTA是目前应用最广泛的血小板聚集检测方法，因此在实验室间进行了多次方法学标准化的尝试。然而，由于没有国际标准试剂，这个问题仍然没有解决。LTA的另一个缺点是使用PRP。LTA对低血小板计数也很敏感。此外，由于PRP和PPP的产生，LTA分析需要相对较大的血容量，特别是同时使用几种激动剂时。最后，该测试比较耗时，并且需要熟练的工作人员来分析性能和进行结果解释。
3.自动化实验室LTA的改进：LTA分析中的上述缺点促进了更易管理的、需要更小血容量的高通量分析的发展。这些试验代表了改良的LTA试验，并要求与LTA相同的样品制备，但它们要么使用标准96孔板，要么在一些自动凝血分析仪上进行检测。这种方法保持了LTA的灵活性，但可以一次性快速评估多个患者的不同激活途径。此外，它只需要标准的基于(酶联免疫吸附测定法)的ELISA设备，但仍然需要有经验的人员来执行测试和结果解释。光透射法检测血小板聚集最近也被引进到自动凝血分析仪(例如, Sysmex CS2000、2500和5100系列)上。对于所有这些方法，仍然需要制备PRP；然而，自动化方法具有PRP和试剂自动移液的优点，因此比传统的聚集仪需要更少的人工操作。该方法已经在健康个体和疑似出血性疾病的个体中进行了测试，与其他方法的相关性较好，但仍有待进一步的临床验证。
4.全血聚集测定法：第一台可评估全血中血小板聚集的仪器是 Chrono-log，它于 1980 年首次推出，采用了多电极聚集测量法。该设备可通过阻抗变化测量血小板聚集，此外，使用荧光素-荧光素酶试剂时，该方法还可同时测定ATP的释放。随后，半自动仪器 Multiplate 分析仪对 Chrono-log 进行了补充。全血聚集测定法的主要优点是能在相当自然的环境中分析血小板。此外，该方法所需的样本量比 LTA 少，耗时短，比 LTA 更容易操作。检测结果不受血脂或胆红素血症的影响，但受血小板计数的影响。另一方面，有些方法非常昂贵(一次性试剂盒)或分析范围有限（即标准多板检测板）。
5.血小板功能分析仪：血小板功能分析仪( PFA 100 / 200 )于1995年推出，是对Thrombostat 4000检测的改进。与阻抗聚集仪一样，它也能评估全血中的血小板聚集情况。PFA 100 / 200是一项全面的止血功能检测，能够检测或排除严重的血管性血友病、血小板紊乱和影响血小板的药物（主要是阿司匹林）。该检测对VWF水平高度敏感，因为血栓的形成在很大程度上依赖于VWF，特别是在高剪切应力条件下。此外，该分析对血小板计数和红细胞压积也很敏感，但由于是对血小板(和VWF )的全面检测，因此无法区分特定的疾病。另外，CT可能会因摄入某些食物或补充剂以及非处方药物而延长。
6.VerifyNow：VerifyNow是一种即时检测仪器，可通过基于比浊法的光学检测对全血中的血小板功能进行检测。该设备专门用于通过对纤维蛋白原的亲和力来确定抗血小板治疗(阿司匹林或P2Y12抑制剂)的效果，不适用于其他用途。由于它不需要对样本进行任何处理，因此无需专业实验室的参与就能轻松完成，所以常用于急性病的检测。不过，VerifyNow 对阿司匹林作用下降的敏感性可能不如 LTA 等其他方法，而且制造商的临界值也缺乏临床验证。
7.IMPACT: 锥板(Let)分析仪：锥板( let )分析仪是一种用于体外评价血小板功能的即时检测仪器。这种方法的显著优点是模拟了原发性止血的生理条件。此外，无需血液处理，并且完全自动化，只需要少量样本。然而，该方法高度依赖于血浆蛋白、红细胞压积和血小板计数。
8.PlateletWorks：PlateletWorks可检测全血中的血小板聚集，主要用于快速检测抗血小板药物的效果。PlateletWorks 与其他基于聚集的方法（如 LTA 和阻抗聚集测定法）之间的相关性一般。此外，该方法在很大程度上还没有经过临床验证。
9.流式细胞仪：有些血小板功能紊乱很难用前面介绍的方法检测出来。特别是，贮存池缺陷很难通过常规的实验室测试来识别，因此，需要更深入细致的测试。流式细胞术既可以识别表面蛋白的缺乏，也可以鉴定由颗粒缺乏或颗粒释放缺陷导致的颗粒不足。在分析颗粒能力时，有必要在荧光团标记前透化膜，以评估细胞内成分。对血小板聚集的流式细胞分析也有描述。
流式细胞仪分析血小板功能对表面蛋白和细胞内蛋白表达减少的敏感性很高，而且可以在一个样本中检测多种活化标志物。由于血小板是单独计数的，因此该方法不像LTA或阻抗聚集测定法那样受血小板计数的影响，并且可以在低至1 mL的血液中进行。此外，检测组合可以单独设计，在研究和临床使用中都具有很高的自由度。其缺点是仪器成本高，操作过程耗费大量人力，而且分析工作对技术人员的要求甚至高于 LTA。此外，对结果的解释也具有挑战性。
10.血栓弹性测定法和血栓弹力图：标准ROTEM和TEG方案均无法检测血小板功能。然而，ROTEM和TEG均可进行血小板聚集试验。聚集仪可作为ROTEM的附加设备，根据阻抗聚集测定法测量全血中的血小板聚集。通过添加花生四烯酸和ADP作为激动剂，血小板模块可以评价抗血小板药物的效果。TEG血小板图谱系统也为测量抗血小板治疗的效果提供了机会。然而，在临床上应用ROTEM或TEG检测血小板功能仍需时日。
03血小板功能检测的影响因素
1.分析前因素：对于所有动态血小板功能检测，都应采取预防措施，避免样本中的血小板在分析前被过度活化，因为这将导致虚假的检测结果。与患者和采样相关的多种因素都会影响分析前的血小板活化。除此之外，其他因素如抗凝剂的选择、运输途径、缓冲液和测量时的温度等都会对结果产生影响。
2.患者相关因素：昼夜节律、咖啡饮用量、吸烟、运动、食物摄入量、药物（如非甾体类抗炎药，NSAIDs） 或膳食补充剂（如鱼油）都是影响血小板活化的因素。因此，理想情况下，患者应在早晨空腹时采集血样，采血当天早晨不喝咖啡、不吸烟、不运动，并在过去 10 至 14 天内暂停服用相关药物，包括非处方药和膳食补充剂。
3.采血因素：在采血过程中，静脉穿刺时内皮损伤会暴露胶原和组织因子，并导致内皮释放血小板活化因子。因此，建议在最小止血带压力下，使用19 ~ 21号针头和短连接管，顺利静脉穿刺获得的血液用于血小板功能分析。一些指南建议丢弃前几毫升，原理是避免管道中的内皮源性激活物质，如果使用带有预抽真空的试管系统，则是为了填充连接处的死腔，并避免空气混入，从而影响血液与抗凝剂的比例。
4.试管及抗凝剂的选择：应将血液抽入表面不活化的试管中，如聚丙烯试管。
5.运输和储存条件：建议直立运输样品，避免气动管道系统或其他使样本受到较高机械力的运输系统62。因为先前的研究表明，使用气管系统可能会影响血小板功能测试。调查储存时间对血小板功能检测结果影响的研究发现，在采血后的前30分钟内，血小板活化程度显著增加。因此，建议血液样本在分析前至少静置30分钟。抗凝剂的选择也会对结果产生影响，肝素化血液的稳定性比柠檬酸化血液更长。最后，储存温度会对结果产生影响。因此，建议样本在室温下保存。
04结论与展望
未来研究和发展的另一个重要问题是方法的标准化，既要尽量减少分析前的差异，又要能够进行跨实验室的比较。在这些情况下，血小板功能检测对诊断和预后的临床价值仍有待阐明。
来源：武汉亚洲心脏病医院检验医学中心
